Что такое секвенирование по сэнгеру?

Секвенирование по Сэнгеру — это метод определения последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК. Он был разработан физиком Фредериком Сэнгером в 1977 году и является одним из основных методов декодирования генома.

Принцип секвенирования по Сэнгеру основан на использовании ДНК-полимеразы, фрагментов ДНК или РНК, меченых радиоактивными или флуоресцентными метками, и набора дидезоксинуклеотидов. Отличительной особенностью метода является его капиллярная электрофорезная система, позволяющая автоматизировать процесс секвенирования.

Основная идея метода заключается в том, что при синтезе новой цепи ДНК или РНК происходит случайное включение дидезоксинуклеотида, который прерывает синтез и определяет конкретную нуклеотидную последовательность. Установив периодичность появления дидезоксинуклеотида, можно определить последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте.

Секвенирование по Сэнгеру является основой для последующих разработок в области геномики и функциональной геномики. Оно позволило значительно ускорить и удешевить процесс декодирования полного генома организмов. На сегодняшний день, секвенирование по Сэнгеру остается значимым методом в биологических исследованиях.

Что такое секвенирование по Сэнгеру?

Секвенирование по Сэнгеру является одним из основных методов для определения последовательности ДНК или РНК. Этот метод был разработан Фредериком Сэнгером и его коллегами в конце 1970-х годов и получил широкое применение в генетике, молекулярной биологии и биотехнологии.

Принцип секвенирования по Сэнгеру основан на использовании ДНК-полимеразы и комплементарности азотистых оснований ДНК. В ходе реакции секвенирования, ДНК-полимераза копирует исследуемую цепь ДНК с помощью добавления комплементарных нуклеотидов.

Однако в реакционной смеси присутствуют не только обычные нуклеотиды (A, T, G, C), но также и дидезоксинуклеотиды (ddNTP), которые прекращают продление ДНК-цепи в случайной позиции. В результате смешивания продленных цепей разных длин и их последующего разделения по размеру, можно определить последовательность нуклеотидов на исходной ДНК-цепи.

Для анализа последовательности используется автоматический ДНК-анализатор, который позволяет считывать данные с пептидных гелей или капиллярных гелеобразующих полимеров. Эти данные представляются в виде электроферограмм, в которых каждая пиковая пара соответствует одному нуклеотиду.

Преимущества секвенирования по Сэнгеру включают его точность и возможность определения одновременной последовательности множества цепей ДНК или РНК. Однако этот метод относительно дорог и медленен, поэтому с развитием технологий эта методика стала заменяться более современными методами секвенирования.

Происхождение метода

Метод секвенирования по Сэнгеру (также известный как метод дидеоксинуклеотидной цепной терминировки или Sanger sequencing) был разработан Фредериком Сэнгером в 1977 году.

С введением этого метода секвенирование ДНК стало возможным на практике. Сэнгер изменил подход, предложенный Максом Гильбертом и Уолтером Гилсоном в 1960-х годах, и разработал усовершенствованную методику, которая стала основой современного секвенирования ДНК.

Метод Сэнгера основан на использовании модифицированных дидеоксинуклеотидов (или ddНТП), которые прерывают длину полимерного цепного продукта ДНК в разных точках. В результате получаются фрагменты ДНК разной длины, которые можно разделить на основе их размера с помощью электрофореза и определить последовательность нуклеотида в каждом фрагменте.

Этот метод значительно упростил и ускорил секвенирование ДНК. Впервые стало возможным проводить детальное и точное определение последовательности нуклеотидов в геноме. Сейчас метод Сэнгера является классическим и широко используется в многих лабораториях по биологии и генетике.

Принципы работы

Секвенирование по Сэнгеру (также известное как метод декодирования дезоксирибонуклеиновой кислоты) основано на принципе дополнения. Этот метод позволяет определить последовательность нуклеотидов в ДНК.

В основе секвенирования по Сэнгеру лежат четыре основных принципа:

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): Для секвенирования необходимо получить множество идентичных ДНК-фрагментов. Для этого применяется ПЦР, которая позволяет амплифицировать (умножить) исходную ДНК в кратные разы. Этот процесс основан на использовании фермента ДНК-полимеразы, который синтезирует новые цепи ДНК на основе имеющихся материалов.
2. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTPs): Для синтеза новой ДНК-цепи необходимы строительные блоки в виде дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTPs). Они представляют собой нуклеотиды (A, T, C, G), каждый из которых содержит дезоксирибозу, фосфатную группу и одну из четырех азотистых оснований. dNTPs встраиваются в синтезирующуюся ДНК-цепь, образуя позвоночник ДНК.
3. Метка на концах ДНК-фрагментов: Для различения последовательностей нуклеотидов в секвенировании по Сэнгеру необходимо добавить метку на концы ДНК-фрагментов. Это обеспечивается использованием дезоксирибонуклеозидтрифосфата, содержащего дигоксигениновую метку. Однако в каждой реакционной смеси вводится только один из четырех возможных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с меткой, что позволяет различить концы возрастающей ДНК-цепи и точно определить последовательность нуклеотидов.
4. Электрофорез: Для чтения результатов секвенирования используется электрофорез – способ разделения и анализа молекул в зависимости от их электрического заряда и размера. В процессе электрофореза фрагменты ДНК разделяются по длине в полимерном геле, который содержит контрольную ДНК-цепь, известную последовательность которой используется для сравнения с исследуемыми фрагментами.

В результате секвенирования по Сэнгеру получается графическое представление последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК. Эта последовательность может быть использована для различных целей, включая изучение генетических вариаций, исследование биологических процессов и диагностику генетических заболеваний.

Особенности метода

• Секвенирование по Сэнгеру является «золотым стандартом» в молекулярной биологии и генетике. Этот метод используется для определения последовательности нуклеотидов в ДНК.
• Секвенирование по Сэнгеру основано на принципе синтеза ДНК, при котором применяются дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP). Особенностью метода является использование двух типов дезоксинуклеотидтрифосфатов: дезоксинуклеотидтрифосфатов четырех форм – A, T, G, C и дезоксидидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddNTP) — A, T, G, C.
• Дезоксинуклеотидтрифосфаты являются компонентами для ДНК-синтеза, а дезоксидидезоксинуклеотидтрифосфаты не содержат группу 3′-ОН, что и приводит к преждевременному окончанию ДНК-цепи.
• При секвенировании по Сэнгеру используются ДНК-полимеразы, шаблонная ДНК, праймеры, дезоксинуклеотидтрифосфаты, дезоксидидезоксинуклеотидтрифосфаты и флуоресцентно-привязанные метки, которые привязываются к дезоксидидезоксинуклеотидтрифосфатам.
• Особенностью метода является использование разных флуорофоров для меченных дезоксидидезоксинуклеотидтрифосфатов, что позволяет визуализировать разные нуклеотиды и определить их последовательность в ДНК.
• Уникальность метода секвенирования по Сэнгеру заключается в том, что он позволяет считывать относительно короткие (до 1 килобазы) фрагменты ДНК, обладающие целыми числом их начала и конца.
• Одна из основных особенностей секвенирования по Сэнгеру заключается в том, что процесс может занимать продолжительное время.
• Секвенирование по Сэнгеру является точным и надежным методом, позволяющим получить достоверные результаты последовательности нуклеотидов. Однако, данный метод часто используется для анализа относительно небольших фрагментов ДНК и для подтверждения других результатов секвенирования, полученных современными методами.

Применение секвенирования по Сэнгеру

Секвенирование по Сэнгеру является одним из основных методов для определения последовательности ДНК или РНК. Одной из наиболее широко распространенных областей применения метода является генетика, где он используется для анализа генома, поиска генетических вариаций и мутаций.

Метод секвенирования по Сэнгеру также широко применяется в медицине. Он может использоваться для диагностики генетических заболеваний, таких как наследственные формы рака или генетические нарушения, а также для определения эффективности лекарственных препаратов на основе индивидуальных генетических характеристик пациента.

Секвенирование по Сэнгеру также находит применение в исследованиях микроорганизмов и вирусов. Этот метод позволяет идентифицировать и классифицировать разные штаммы и виды микроорганизмов, исследовать их эволюцию и распространение, а также выявлять наличие и изменения вирусных геномов.

Особенной областью применения секвенирования по Сэнгеру является археология и палеогенетика. Благодаря этому методу ученые могут изучать древние организмы и исследовать их генетическую структуру, а также получить информацию о родственных связях между различными видами.

Кроме того, секвенирование по Сэнгеру применяется в сельском хозяйстве для селекции и улучшения сортов растений и животных. Оно позволяет ученым исследовать генетическое разнообразие и определять генетические свойства, такие как устойчивость к болезням или высокая урожайность. Это помогает селекционерам создавать новые сорта с улучшенными характеристиками.

В целом, секвенирование по Сэнгеру является существенным инструментом в молекулярной биологии и генетике. Оно позволяет исследователям получать информацию о генетической структуре организмов и применять ее в различных областях науки и медицины.

Вопрос-ответ

Как работает метод секвенирования по Сэнгеру?

Метод секвенирования по Сэнгеру основан на последовательном добавлении дидезоксинуклеотидов (ddNTP) к растущей ДНК-цепи. Каждый ddNTP содержит специальный терминатор, который прекращает дальнейшее продление цепи ДНК. После реакции с добавлением ddNTP, получается набор фрагментов ДНК разной длины, которые могут быть разделены по размеру с помощью электрофореза. Таким образом, можно определить последовательность нуклеотидов в исходной ДНК.

Какие преимущества имеет секвенирование по Сэнгеру?

Секвенирование по Сэнгеру является классическим и проверенным методом секвенирования. Он может обеспечить точность секвенирования до единственного нуклеотида, что особенно важно при исследовании генетических вариаций. Кроме того, секвенирование по Сэнгеру относительно простое в выполнении и имеет небольшую стоимость по сравнению с некоторыми другими методами секвенирования.

Какие ограничения имеет метод секвенирования по Сэнгеру?

Метод секвенирования по Сэнгеру имеет ограничения в длине секвенируемого фрагмента. Обычно с помощью этого метода можно определить последовательность только до нескольких сотен нуклеотидов. Также, секвенирование по Сэнгеру требует чистой и высококачественной образца ДНК и продолжительного процесса подготовки проб, что может быть трудоемким и затратным. В сравнении с более современными и высокопроизводительными методами секвенирования, секвенирование по Сэнгеру видится менее эффективным при исследованиях больших объемов генома.